२५ दिनको स्थिर इन्क्युबेशन २८°C मा पछि, *Pleurotus ostreatus* NRC620 बाट आएको ल्याकेसले फंगल कल्चर माध्यममा उच्चतम गतिविधि देखायो। यस इन्जाइमको लागि इष्टतम pH र तापमान मानहरू क्रमशः ३.० र ७०°C थिए। ४०°C र ५०°C मा २ घण्टा इन्क्युबेशन पछि, इन्जाइम गतिविधि क्रमशः ६८.३३% र ५९.६१% कायम रह्यो। साइट्रेट-फस्फेट बफर (pH ७.०) मा २ घण्टा इन्क्युबेशन पछि, इन्जाइम गतिविधि १००% मा रह्यो। १० mM MgSO₄ र CuSO₄ थप्दा इन्जाइम गतिविधि क्रमशः लगभग २१% र ३५% ले बढ्यो, जबकि NaCl, MnCl₂, KCl, र CaCl₂ ले इन्जाइम गतिविधिलाई रोक्यो। ABTS लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गर्दा, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase को गतिज प्यारामिटरहरू (Km र Vmax) क्रमशः 1.99 mM र 16,217 μmol min−1 L−1 थिए। स्याउको रसको नमूनाहरूको इन्जाइम्याटिक उपचारले pH र चिपचिपापन दुवैलाई उल्लेखनीय रूपमा घटायो, र यो कमी भण्डारण समयमा वृद्धिसँग सम्बन्धित थियो। ल्याक्केस उपचारले स्याउको रसको कुल फेनोलिक सामग्रीमा थोरै कमी ल्यायो, तर एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधिमा कुनै कमी देखिएन।
हालैका वर्षहरूमा, अनुसन्धानकर्ताहरूले खाद्य उद्योगमा हरियो जैविक प्रविधिको प्रयोगमा ध्यान केन्द्रित गरेका छन्। ल्याकेस खाद्य उद्योगमा सबैभन्दा उपयोगी इन्जाइमहरू मध्ये एक हो, जसले जुस प्रशोधन, बेकिंग, वाइन स्थिरीकरण, र खाद्य उत्पादनहरूको अर्गानोलेप्टिक गुणहरू सुधार गर्ने जस्ता क्षेत्रहरूमा प्रयोग गर्दछ।1धेरै उच्च वनस्पति र सूक्ष्मजीवहरूले ल्याकेस स्राव गर्छन्,2र ड्युटेरोमाइसेट्स, एस्कोमाइसेट्स र बेसिडियोमाइसेट्स जस्ता फङ्गाले पनि ल्याकेस उत्पादन गर्न सक्छन्।3ल्याकेस (EC १.१०.३.२) एक नीलो अक्सिडेज हो जसले तीन फरक तामा परमाणुहरू मिलेर बनेको प्रणाली प्रयोग गरेर आणविक अक्सिजनलाई पानीमा घटाउँछ, जसले गर्दा विभिन्न फेनोलिक यौगिकहरू र सुगन्धित एमाइनहरूलाई अक्सिडाइज गर्छ। फलफूल र तरकारीको रस उत्पादनको क्रममा, इन्जाइमेटिक र गैर-इन्जाइमेटिक ब्राउनिङ महत्वपूर्ण समस्याहरू हुन्।4यी पदार्थहरूले रसको रंग, स्वाद र सुगन्धमा नकारात्मक असर पार्ने भएकाले, तिनीहरूलाई हटाउनु पर्छ।5
सबै फलफूलमध्ये, स्याउ विश्वभर र युरोपेली संघमा सबैभन्दा बढी खपत हुन्छ। २०१९ मा, स्याउ उत्पादन ८ करोड ७० लाख टन भन्दा बढी भएर विश्वव्यापी रूपमा तेस्रो स्थानमा थियो।6स्याउमा धेरै फेनोलिक यौगिकहरू हुन्छन्, जसमा फ्लेभोनोइड्स र क्याफिक एसिड र क्लोरोजेनिक एसिड जस्ता फेनोलिक एसिडहरू समावेश छन्।7स्याउको रस सामान्यतया यसको स्पष्ट रूपमा खपत हुने भएकोले, निस्पंदन प्रक्रियाको क्रममा लगभग ५०% देखि ९०% फेनोलिक घटकहरू हराउँछन्।8आजभोलि, उपभोक्ताहरूले उच्च पोलिफेनोल सामग्री भएको बादल लागेको स्याउको जुस जस्ता न्यूनतम प्रशोधित उत्पादनहरू छनौट गर्छन्। यद्यपि, यसको उच्च फेनोलिक सामग्रीको कारण, यस प्रकारको स्याउको जुस विशेष गरी रङ्ग र कालो हुने सम्भावना बढी हुन्छ।9स्याउको रसलाई कालो हुनबाट रोक्न वा कम गर्न ६०-९० डिग्री सेल्सियसमा पाश्चराइजेसन जस्ता ताप उपचार विधिहरू सहित विभिन्न प्रविधिहरू प्रयोग गरिन्छ।10यद्यपि, Sauceda-Gálvez द्वारा अनुसन्धान अनुसार11, थर्मल प्रशोधनले वाष्पशील रसायनहरूलाई नष्ट गर्न सक्छ र स्याउको रसको अर्गानोलेप्टिक गुणहरूलाई असर गर्न सक्छ। थर्मल प्रशोधन विधिहरूको विकल्पहरूमा सुपरक्रिटिकल कार्बन डाइअक्साइड, पराबैंगनी विकिरण, अल्ट्रासाउन्ड, उच्च हाइड्रोस्टेटिक दबाव, वा उच्च-दबाव एकरूपता समावेश छ।12यी प्रविधिहरूको दक्षता र उपयुक्त फलफूलको रसको उत्पादन प्रयोग गरिएका प्यारामिटरहरू र उत्पादन विशेषताहरूमा निर्भर गर्दछ। उच्च लागत, केही खाद्य उत्पादनहरूको गुणस्तरमा प्रतिकूल प्रभाव, वा अपर्याप्त इन्जाइम निष्क्रियताले गर्दा तिनीहरूको व्यापक प्रयोग सीमित छ।१३,१४
फलफूलको रसलाई स्थिर र स्पष्ट बनाउन लाकेस प्रयोग गर्न सकिन्छ।15गोकमेन एट अल।16फलफूलको रस स्पष्टीकरणको लागि ल्याकेसको प्रयोग सिफारिस गर्नुहोस् किनभने यसले प्रभावकारी रूपमा फेनोलिक यौगिकहरूलाई पोलिमर वा ओलिगोमरमा रूपान्तरण गरेर हटाउँछ जुन कुनै पनि अल्ट्राफिल्ट्रेसन झिल्लीद्वारा सजिलै हटाइन्छ, जसले गर्दा स्याउको रसलाई ५० डिग्री सेल्सियसमा छ हप्तासम्म स्थिर रंग र स्पष्टता कायम राख्न अनुमति दिन्छ। शुद्ध *ट्राइकोडर्मा* ल्याकेसलाई एल्युमिना मोतीहरूमा स्थिर बनाइएको थियो र स्याउको रसको माइक्रोबियल दूषितताको कारणले हुने अफ-फ्लेवर यौगिकहरूलाई छनौट रूपमा हटाउन प्रयोग गरिएको थियो।17
स्याउको रसको लगभग ८०-९०% वाष्पशील घटकहरू एस्टर र एल्डिहाइडहरू हुन्, जसले रसमा एक अद्वितीय सुगन्ध प्रदान गर्दछ।18स्याउको रस स्पष्ट पार्नको लागि *ट्रामेटेस भर्सिकलर* बाट ल्याकेसलाई नरिवलको बोक्राबाट प्राकृतिक फाइबरबाट बनेको सस्तो सपोर्टमा स्थिर गरिएको थियो।19अघिल्ला अध्ययनहरूले इन्जाइम-रहित वा स्थिरीकरण विधिहरू प्रयोग गरेर वा अल्ट्राफिल्ट्रेसनसँग संयोजनमा स्याउको रसको स्थिरीकरण (रङ र टर्बिडिटी) को अनुसन्धान गरेका छन्।५,१९यद्यपि, भण्डारणको समयमा स्याउको रसको भौतिक-रासायनिक गुणहरूमा फंगल ल्याकेसेसको प्रभाव अस्पष्ट छ। त्यसकारण, यस अध्ययनको उद्देश्य फंगल ल्याकेसेसको उपचार र दुई-हप्ताको फ्रिज भण्डारण पछि स्याउको रसको भौतिक-रासायनिक गुणहरू, फेनोलिक यौगिक सामग्री, र एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधिमा हुने परिवर्तनहरूको प्रयोगात्मक रूपमा अनुसन्धान गर्नु थियो। ल्याकेसेसमा फेनोलिक यौगिकहरूलाई अक्सिडाइज गर्ने क्षमता हुन्छ, जसले तिनीहरूलाई रस स्पष्टीकरण सहित विभिन्न औद्योगिक प्रक्रियाहरूमा प्रयोगको लागि आशाजनक बनाउँछ। यस अध्ययनले *Pleurotus ostreatus* NRC 620 बाट ल्याकेसेसहरूको जाँच गर्यो, तिनीहरूको गतिविधिको लागि आदर्श अवस्था र रस स्पष्टीकरणमा प्रभावकारितामा केन्द्रित। ओइस्टर च्याउ (P. ostreatus NRC 620) मा अनुसन्धान अझै सीमित छ, अघिल्लो अध्ययनहरूले विभिन्न फंगल स्रोतहरू, जस्तै Trametes versicolor र Ganoderma lucidum बाट इन्जाइमहरूको जाँच गरेका छन्। यस अध्ययनको उद्देश्य खाद्य उद्योगमा यो इन्जाइमको सम्भावित प्रयोगको मूल्याङ्कन गर्नु र यसको अद्वितीय गुणहरू, विशेष गरी यसको आदर्श pH र तापमानलाई हाइलाइट गर्नु थियो।
२,२′-Azooxybis(३-ethylbenzothiazoline-६-sulfonic acid) (ABTS) सिग्मा-एल्ड्रिच (क्यानाडा) बाट खरिद गरिएको थियो। अन्य सबै अभिकर्मकहरू विश्लेषणात्मक ग्रेडका थिए।
राष्ट्रिय अनुसन्धान केन्द्रको माइक्रोबियल कल्चर सङ्कलन केन्द्रले ज्ञात ओइस्टर च्याउ स्ट्रेन NRC620 प्राप्त गर्यो। उप-संस्कृति पछि, यो स्ट्रेन आलु डेक्सट्रोज अगर स्ल्यान्टमा ४ डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरिएको थियो। इनोकुलम तयारी विधि निम्नानुसार थियो: १० दिन पुरानो, पूर्ण रूपमा विकसित माइसेलियमलाई आलु डेक्सट्रोज अगर प्लेटहरूमा इनोकुलेट गरिएको थियो र २८ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरिएको थियो। १० दिन पछि, तीन १२-मिमी-व्यास माइसेलियल ब्लकहरू एक बाँझ धातु पंच प्रयोग गरेर अगर मिडियाबाट हटाइयो र २५०-मिली एर्लेनमेयर फ्लास्कमा ५० एमएल बाँझ कल्चर माध्यम (पीएच ५.०, पहिले वर्णन गरिए अनुसार ओथमान एट अल द्वारा) भएको कपास प्लगहरू सहित राखिएको थियो।20)। कल्चरहरूलाई १८ दिनको लागि २८°C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। त्यसपछि कल्चरहरूलाई व्हाटम्यान नम्बर १ फिल्टर पेपर मार्फत फिल्टर गरिएको थियो, र परिणामस्वरूप प्राप्त सुपरनेटेन्टले इन्जाइम स्रोतको रूपमा काम गर्यो।
ABTS लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गरेर लाकेस गतिविधि निर्धारण गरिएको थियो। प्रतिक्रिया मिश्रण (२ एमएल) मा ५०० μL ०.३ एमएम ABTS (०.१ एम सोडियम साइट्रेट बफर, pH ४.५ मा घुलनशील) र आवश्यक मात्रामा इन्जाइम नमूना डिस्टिल्ड पानीले पातलो पारिएको थियो।२१,२२कोठाको तापक्रम (२८ डिग्री सेल्सियस ± २) मा ल्याकेसले ABTS लाई अक्सिडाइज गर्न सक्छ भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, ABTS अक्सिडेशन ४२० nm (ε) मा अवशोषण वृद्धि मापन गरेर निर्धारण गरिएको थियो।४२०= ३६,००० सेमी-1 M -1) Agilent Carry-100 UV स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर। प्रति मिनेट १ μmol ABTS अक्सिडाइज गर्न laccase गतिविधिको एक एकाइ आवश्यक थियो। प्रोटिन सांद्रता ब्राडफोर्ड विधिद्वारा गोवाइन सीरम एल्बुमिनलाई आन्तरिक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।२३,२४
ओइस्टर च्याउ स्ट्रेन NRC 620 बाट इन्जाइम प्राप्त गरेपछि, यसको गतिविधि २८ डिग्री सेल्सियसमा स्थिर अवस्थामा २५ दिनको लागि विभिन्न खेती अन्तरालहरूमा मापन गरिएको थियो।
ल्याकेस गतिविधिमा तापक्रमको प्रभाव अध्ययन गर्न, २० देखि ९० डिग्री सेल्सियसको तापक्रम दायरामा प्रयोगहरू गरिएको थियो। इन्जाइम थप्नु र प्रतिक्रिया सुरु गर्नु अघि, बफर (०.१ एम सोडियम साइट्रेट, पीएच ४.५) र सब्सट्रेट (एबीटीएस) लाई विभिन्न तापक्रममा ५ मिनेटको लागि मिसाएर इन्क्युबेट गरिएको थियो। इन्जाइम थर्मल स्थिरतालाई क्रमशः ४०, ५०, ६० र ७० डिग्री सेल्सियसमा २ घण्टाको लागि ०.०५ एम सोडियम फस्फेट बफर (पीएच ७.०) मा इन्क्युबेशन गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। त्यसपछि ABTS सब्सट्रेट प्रयोग गरेर अवशिष्ट गतिविधिको मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
२.५ देखि ७.० को pH दायरा भएका ०.१ M साइट्रेट-फस्फेट बफरहरूमा ABTS लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गरेर ल्याकेस गतिविधिमा pH को प्रभावको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। pH स्थिरता मूल्याङ्कन गर्न इन्जाइम घोललाई ०.१ M साइट्रेट र ट्रिस बफरहरू (pH ३, ४, ६, र ७) मा दुई घण्टाको लागि ४०°C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। इन्क्युबेशन पछि सब्सट्रेटको रूपमा ABTS सँगको अवशिष्ट गतिविधि गणना गरिएको थियो।
ल्याकेसलाई १० मिनेटको लागि सोडियम फस्फेट बफर (०.०५ एम, pH ७.०) मा क्रमशः २.५ एमएम र १० एमएमको सांद्रतामा विभिन्न धातु आयनहरू (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, र Mn2+) भएको इन्क्युबेट गरिएको थियो। त्यसपछि प्रतिक्रिया सुरु गर्न सब्सट्रेट (ABTS) थपियो, र सापेक्षिक गतिविधि मूल्याङ्कन गरियो।
गतिज प्यारामिटरहरू (Vmax र Km) निर्धारण गर्न pH ४.५ मा विभिन्न सांद्रता (०.०२५–३ mM) मा ल्याकेसद्वारा ABTS अक्सिडेशन मापन गरिएको थियो। गतिजस्थिरांकहरूमाइकलिस-मेन्टेन समीकरणको गणना लाइनविभर-बर्क प्लट प्रयोग गरेर गरिएको थियो, जसले सब्सट्रेट सांद्रताको कार्यको रूपमा प्रतिक्रिया दरको पारस्परिक प्लट गर्दछ। गतिज स्थिरांकहरू ग्राफप्याड प्रिज्म संस्करण 6.01 सफ्टवेयर प्रयोग गरेर लाइनविभर-बर्क प्लटबाट गणना गरिएको थियो।
स्याउलाई धाराको पानीले राम्ररी धोएपछि, तिनीहरूलाई आधा भागमा काटियो र पूर्ण स्वचालित ब्राउन MP80 एप्पल जुसर (जर्मनीमा बनेको) प्रयोग गरेर रस निकालियो। रसलाई चीजक्लोथको चार तहहरू मार्फत फिल्टर गरियो। नियन्त्रण समूहमा कुनै इन्जाइमहरू थपिएनन्, जबकि २.०% ल्याकेस (सबैभन्दा प्रभावकारी सांद्रता परीक्षण गरिएको) ताजा तयार पारिएको स्याउको रसमा थपियो, जुन त्यसपछि ४ डिग्री सेल्सियसमा दुई हप्ताको लागि भण्डारण गरियो।
टाइट्रेटेबल एसिडिटी (TA) र pH बोल्टन एटको विधि अनुसार निर्धारण गरिएको थियो।अल.२७। प्रत्येक नमूनाको pH डिजिटल pH मिटर (JENWAY 3510 pH मिटर) प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो। टाइट्रेटेबल अम्लता (TA) निम्न सूत्र प्रयोग गरेर मालिक एसिडको आधारमा गणना गरिएको थियो।
जहाँ V र C क्रमशः टाइट्रेसनमा प्रयोग हुने सोडियम हाइड्रोक्साइड घोलको आयतन (mL) र सांद्रता (0.1 mol/L) हो। K भनेको मालिक एसिड रूपान्तरण गुणांक हो, जुन ०.०६७ बराबर हुन्छ, र W भनेको स्याउको रसको पिण्ड (g) हो।
कुल घुलनशील ठोस पदार्थहरू (टीडीएस) सबै रस नमूनाहरूको सामग्री PAL-1 पकेट रिफ्र्याक्टोमिटर (ATAGO, टोकियो, जापान) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो। प्रत्येक मापन पछि, अप्टिकल लेन्सलाई डिआयोनाइज्ड पानीले पखालिएको थियो, र प्रत्येक स्याउको रस नमूना तीन पटक परीक्षण गरिएको थियो। प्रत्येक नमूनाको मान तीन मापनहरूको औसत द्वारा गणना गरिएको थियो। प्रत्येक स्याउको रस नमूनाको लागि औसत ± मानक विचलन पनि यी परिणामहरूको औसत द्वारा गणना गरिएको थियो।
स्याउको रसको नमूनाहरूको भिस्कोइलास्टिकिटी घुमाउरो भिस्कोमिटर (RV, रियोटेस्ट २, जर्मनी) प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। नमूना भिस्कोमिटरको "S2" सिलिन्डर भित्र राखिएको थियो। स्पष्ट चिपचिपापनलाई शियर स्ट्रेस बनाम शियर रेट कर्भको ढलानद्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको थियो, जुन शियर स्ट्रेस र विभिन्न शियर दरहरूमा सम्बन्धित वक्रहरूबाट गणना गरिएको थियो (१.०० देखि ४३७.४ s⁻¹ सम्म)। स्पष्ट चिपचिपापन गणना गर्ने सूत्र निम्नानुसार छ:
जहाँ η स्पष्ट चिपचिपापन (cP) हो, τ शियर स्ट्रेस (dyn/cm²) हो, γ शियर रेट (sec⁻¹) हो, र (τ) निम्न सूत्र प्रयोग गरेर टर्क (α) र सिलिन्डर (Z) मानहरू प्रयोग गरेर गणना गरिन्छ: τ = Z . α।
ब्राउनिङ इन्डेक्स मेइडाभ एटको विधि अनुसार निर्धारण गरिएको थियो।अल.२९। १० मिलिलिटरको रसको नमूनालाई १० मिनेटको लागि २७५० xg मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। ५ मिलिलिटर रस सुपरनाट्यान्टलाई ५ मिलिलिटर ९५% इथेनॉलसँग मिसाइएको थियो। मिश्रणको अवशोषणलाई शिमाडजु यूभी स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (UV-१६०१ पीसी) प्रयोग गरेर ४२० एनएम मापन गरिएको थियो।
बोल्टन एट अल द्वारा वर्णन गरिए अनुसार फोलिन-सियोकाल्टेउ अभिकर्मक प्रयोग गरेर कुल फेनोलिक सामग्री (TPC) रंगमितीय रूपमा निर्धारण गरिएको थियो।[२७]]। ० देखि ५०० मिलीग्राम/लिटर सम्मको सांद्रताको लागि ग्यालिक एसिडको मानक वक्र निर्माण गरिएको थियो (चौथो भाग= ०.९९७)। नतिजाहरू ग्यालिक एसिड समतुल्य (मिग्रा GAE/मिली) को रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
२५ μL स्याउको रसमा १२५ μL आसुत पानी र २८५० μL FRAP घोल थप्नुहोस् र मिश्रणलाई अँध्यारो ठाउँमा छोड्नुहोस्।30न्यूनतम। त्यसपछि शिमाडजु यूभी स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (UV-1601 PC) प्रयोग गरेर ५९३ एनएममा अवशोषण मापन गर्नुहोस्। FRAP अभिकर्मक ३०० एमएम एसीटेट बफर (pH ३.६), २० एमएम आइरन(III) क्लोराइड, र १० एमएम २,४,६-ट्रिस(२-पाइरिडाइल) ट्रायजिन (TPTZ) (४० एमएम HCl मा घुलनशील) १०:१:१ को अनुपातमा मिसाएर तयार पारिएको थियो। ट्रोलोक्सलाई मानकको रूपमा प्रयोग गरेर एक मानक वक्र उत्पन्न गरिएको थियो (रु.= ०.९९९), र परिणामहरू μM ट्रोलोक्स/मिलीको रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
उपचार गरिएको र उपचार नगरिएको जुसको एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधि DPPH विधि प्रयोग गरेर DPPH मुक्त रेडिकलहरू हटाउने क्षमताको मूल्याङ्कन गर्न निर्धारण गरिएको थियो।31दस माइक्रोलिटर रसलाई १ मिलि DPPH घोल (१०० μM) मिथानोलमा मिसाइएको थियो। अँध्यारोमा ३० मिनेटसम्म प्रतिक्रिया गरेपछि, मिश्रणको अवशोषण ५१७ nm मा शिमाडजु UV स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (UV-१६०१ PC) प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो। परिणामहरूलाई क्यालिब्रेसन कर्भको आधारमा ट्रोलोक्स समतुल्य (μM ट्रोलोक्स/ml) को रूपमा व्यक्त गरिएको थियो (R2= ०.९९०)।
प्राप्त तथ्याङ्कले किण्वनको १८ औं दिनको अन्त्यसम्ममा NRC ६२० ओइस्टर च्याउमा अधिकतम ल्याकेस उत्पादन अवलोकन गरिएको देखाएको छ, जुन १३०२ U/L को गतिविधिमा पुगेको छ। यसले ल्याकेस उत्पादनको लागि इष्टतम खेती समय निर्धारण गर्ने आधारको रूपमा काम गर्यो (चित्र १)। बढ्दो खेती समयसँगै इन्जाइम उत्पादन बढे पनि, वृद्धि दर खेती समयसँग प्रत्यक्ष रूपमा समानुपातिक थिएन; २१ दिन पछि, इन्जाइम गतिविधि केवल ९० U/L (१३९० U/L) ले बढेको थियो। त्यसकारण, बढेको खेती समयको आर्थिक लाभसँग उत्पादन उत्पादन सन्तुलन गर्न अन्ततः १८ दिनलाई इष्टतम खेती समयको रूपमा चयन गरिएको थियो।
प्ल्युरोटस ओस्ट्रेटस एनआरसी ६२० मा ल्याकेस उत्पादनमा खेती समयको प्रभाव। तीन (१२ मिमी) फंगल माइसेलियल ब्लकहरूलाई ५० मिलिलिटर बाँझ माध्यममा खोप लगाइयो र त्यसपछि विभिन्न समयको लागि २८ डिग्री सेल्सियसमा कल्चर गरियो।
अन्य अध्ययनहरूसँग मिल्दोजुल्दो, हाम्रो नतिजाले फङ्गुद्वारा शिखर ल्याकेस स्राव प्राप्त गर्नको लागि आदर्श संस्कृति अवधि ७ देखि ३६ दिनको बीचमा हुने संकेत गर्दछ।32इजाइक एट अलका अनुसार।33, *ट्रेमेट्स पोलिजोना* WRF03 ले किण्वनको नवौं दिनको अन्त्यसम्ममा सबैभन्दा धेरै मात्रामा ल्याकेस उत्पादन गर्यो, जसको विशिष्ट गतिविधि १६३७ U/mg प्रोटिन थियो। यसबाहेक, ओथमान एट अल।34कल्चरको पाँचौं दिनमा *Trichoderma harzianum* S7113 ले ठूलो मात्रामा ल्याकेस स्राव गरेको पत्ता लाग्यो। ल्याकेस उत्पादन दर चौधौं दिनमा चरम सीमामा पुग्यो र त्यसपछि बिस्तारै घट्यो।34यद्यपि इन्जाइम स्राव मुख्य वृद्धि चरणमा पनि हुन सक्छ, यो सामान्यतया मध्यवर्ती चरणमा चरम सीमामा पुग्छ र कार्बन वा नाइट्रोजन स्रोतको खपतबाट सुरु हुन्छ।३४,३५
यद्यपि Pleurotus ostreatus NRC 620 बाट आएको laccase ले ५०°C देखि ८०°C सम्मको विस्तृत तापमान दायरामा उच्च गतिविधि प्रदर्शन गर्यो, शिखर गतिविधि (६९–९८%) नजिक पुग्यो, यसको अधिकतम गतिविधि ७०°C मा अवलोकन गरिएको थियो (चित्र २a)। यो तापमान दायरा बाहिर, इन्जाइम गतिविधि लगभग ७०°C मा घट्यो। यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि इन्जाइम उच्च तापक्रममा सक्रिय हुन्छ, सम्भवतः उच्च तापक्रमले प्रतिक्रियाको गतिज ऊर्जा बढाउँछ।
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 मा laccase गतिविधिमा प्रतिक्रिया तापमान (a) र pH (b) को प्रभाव। इन्जाइम थप्नु र प्रतिक्रिया सुरु गर्नु अघि ५ मिनेटको लागि मिश्रणलाई फरक-फरक तापक्रममा पूर्व-इन्क्युबेट गरेर २० देखि ९० °C सम्मको तापक्रम प्राप्त गरिएको थियो। २.५ देखि ७.० को pH दायरा माथि ०.१ M साइट्रेट-फस्फेट बफर भएको घोलमा ABTS लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गरेर laccase गतिविधिमा pH को प्रभाव मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
इजाइक एटका अनुसारअल.३३, *Trametes polyzona* WRF03 laccase को लागि इष्टतम तापक्रम ५५ °C हो, जुन *Ganoderma lucidum* को लागि जस्तै हो।लाकेस३६र *Trametes polyzona* KU-RNW02737 को लागि इष्टतम तापक्रम (५० डिग्री सेल्सियस) जस्तैलाकेकेस . बाल्ड्रियन३८अन्य लिग्निन-डिग्रेडिङ इन्जाइम प्रणालीहरू जस्तै, ल्याकेसको लागि आदर्श तापमान दायरा ५० र ७० डिग्री सेल्सियसको बीचमा रहेको कुरा उल्लेख गर्दछ।
नतिजाहरूले देखाए कि इन्जाइमले pH 3.0 मा उच्चतम गतिविधि प्रदर्शन गर्यो, pH 3.5 मा 94% गतिविधिमा पुग्यो। यद्यपि, यो 2.5 देखि 7.0 सम्मको विस्तृत pH दायरामा सक्रिय रह्यो (चित्र 2b)। यसबाहेक, यसले तटस्थ वा क्षारीय अवस्थाहरूको तुलनामा अम्लीय अवस्थाहरूमा उच्च गतिविधि प्रदर्शन गर्यो। यसको गतिविधि 2.5 देखि 4.5 सम्मको pH दायरामा कम्तिमा 77% रह्यो, तर pH 7.0 मा लगभग 38% मात्र पुग्यो। *Trametes polyzona* WRF03 बाट laccase को लागि इष्टतम pH 4.533 थियो, जुन *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, र *Trametes hirsuta* 41 बाट laccases को लागि pH जस्तै हो। यद्यपि, Chairin et al द्वारा गरिएको अध्ययन अनुसार।42, *Polymorpha f. sp.* WR710-1 बाट laccase को लागि इष्टतम pH 2.2 छ, जबकि *Polymorpha f. sp.* IBL-04 बाट laccase को लागि इष्टतम pH 5.043 छ। T2/T3 laccase को तामा परमाणुहरूमा हाइड्रोक्साइड एनियनहरू (laccase अवरोधक) को बन्धन तटस्थ वा क्षारीय pH अवस्थाहरूमा laccase गतिविधि घट्नुको कारण हुन सक्छ। यसले T1 केन्द्रबाट T2/T3 केन्द्रमा आन्तरिक इलेक्ट्रोन स्थानान्तरणलाई बाधा पुर्याउन सक्छ, जसले गर्दासीमित गर्दैइन्जाइम गतिविधि २३,४४
इन्जाइमलाई फरक-फरक तापक्रममा इन्क्युबेट गर्दा, इन्क्युबेशन समय र तापक्रम दुवैले इन्जाइम स्थिरतालाई असर गरेको पाइयो। उल्लेखनीय रूपमा, *Trametes polyzona* NRC 620 बाट आएको ल्याकेसले 40℃ र 50℃ मा उच्च स्थिरता प्रदर्शन गर्यो, 120 मिनेट पछि क्रमशः 68.33% र 59.61% यसको प्रारम्भिक गतिविधि कायम राख्यो (चित्र 3a)। यसको विपरीत, समान अवस्थाहरूमा (40℃ र 50℃, 120 मिनेट), *Trametes polyzona* WRF03 बाट आएको ल्याकेसले क्रमशः 64.38% र 42.92% यसको गतिविधि कायम राख्यो।33यसको विपरीत, बढ्दो इन्क्युबेशन समय र तापक्रमले *Trametes polyzona* NRC 620 laccase को स्थिरता घटायो; ६०℃ र ७०℃ मा ६० मिनेटको लागि इन्क्युबेशन पछि, यसको गतिविधि क्रमशः ३९.२४% र १.७२% मा घट्यो (चित्र ३a)। प्रयोगात्मक परिणामहरूसँग मिल्दोजुल्दो, *Trametes polyzona* WRF03 बाट laccase ले थर्मल उपचार प्रक्रियाभरि ४० र ५०℃ मा उच्च स्थिरता देखायो।33त्यस्तै गरी, लुएङजारोएनकिट एटअल.३७र चेयरिन एटअल.४२Trametes polyzona KURNW027 र Trametes polyzona WR710-1 बाट क्रमशः ५० डिग्री सेल्सियसमा १ घण्टाको लागि ल्याकेसहरूको स्थिरता रिपोर्ट गरियो। विभिन्न जैवप्रविधि क्षेत्रहरूमा लागू हुने उपयोगी जैव उत्प्रेरकको रूपमा, ल्याकेसको फराकिलो तापक्रम दायरामा राम्रो स्थिरता र प्रदर्शन हुनुपर्छ।
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 बाट ल्याकेसको थर्मोस्टेटिक स्थिरता (a) र pH स्थिरता (b)। ०.०५ M सोडियम फस्फेट बफर (pH ७.०) मा क्रमशः ४०, ५०, ६०, र ७० °C मा २ घण्टाको लागि इन्जाइम घोल इन्क्युबेट गरेर थर्मोस्टेटिक स्थिरता मूल्याङ्कन गरिएको थियो। ०.१ M साइट्रेट बफर र ट्रिस बफर (pH ३, ४, ६, र ७) मा ४० °C मा २ घण्टाको लागि इन्जाइम घोल इन्क्युबेट गरेर pH स्थिरता मूल्याङ्कन गरिएको थियो। इन्क्युबेशन पछि सब्सट्रेटको रूपमा ABTS प्रयोग गरेर अवशिष्ट गतिविधि गणना गरिएको थियो।
इन्जाइम प्रयोग र भण्डारणको लागि इष्टतम अवस्थाहरू निर्धारण गर्न, हामीले ल्याकेस स्थिरतामा pH को प्रभावको अनुसन्धान गर्यौं। विभिन्न pH मानहरूको सम्पर्कले प्रोटीन संरचनाको स्थिरतालाई उल्लेखनीय रूपमा असर गर्यो, जसले गर्दा इन्जाइम अणुको स्थिरता र गतिविधिमा प्रभाव पर्यो। नतिजाहरूले देखाए कि एसिडिक अवस्थाहरूमा इन्जाइम कम स्थिर थियो, जबकि यसले उच्च pH मानहरू (तटस्थ र क्षारीय क्षेत्रहरू) मा राम्रो स्थिरता प्रदर्शन गर्यो। ७.०, ६.०, ४.०, र ३.० को pH मानहरूमा, १२० मिनेट पछि इन्जाइम अवधारण दरहरू क्रमशः लगभग १००%, ६२.५४%, ५२.३९%, र ११.१४% थिए (चित्र ३b)। *स्ट्रोम्बस मल्टिसस* WRF03 ल्याकेसले तटस्थ pH मानहरू (५.५–६.५) मा उच्च स्थिरता र अम्लीय pH मानहरूमा कम स्थिरता देखायो (४.० भन्दा कम)। ५.५, ६.० र ६.५ को pH मानहरूमा १२० मिनेट पछि, इन्जाइम अवधारण दर क्रमशः लगभग ८२%, १००% र ९३% थियो।33खैरिन एट अल।42उल्लेख गरे कि ट्रामेटेस पोलिजोना WR710-1 बाट ल्याकेस 6.0 देखि 7.0 को pH दायरामा स्थिर थियो, जबकि सय्यद एट अल।45लेककेस तटस्थ pH अवस्थामा बढी स्थिर रहेको देखाएको छ। यद्यपि, सेरेना युनिकलरको लेककेसले क्षारीय अवस्थाहरूमा पनि स्थिरता प्रदर्शन गरेको छ (pH 9.0)46अध्ययन गरिएका लाककेसहरूले विस्तृत pH दायरामा उच्च स्थिरता देखाए। यो औद्योगिक अनुप्रयोगहरूको लागि एक महत्त्वपूर्ण विशेषता हुन सक्छ।
केही धातु आयनहरूको इन्जाइम गतिविधिमा उत्तेजक र निरोधात्मक दुवै प्रभाव हुने भएकोले, औद्योगिक प्रयोगहरूमा इन्जाइम गतिविधिमा तिनीहरूको प्रभावलाई विचार गर्नुपर्छ। यो महत्त्वपूर्ण छ किनभने धातु आयनहरू सामान्य वातावरणीय दूषित पदार्थ हुन् जसले बाह्य कोशिकीय इन्जाइमहरूको स्थिरता र संश्लेषणलाई असर गर्न सक्छ।47*Pleurotus ostreatus* NRC 620 बाट laccase मा धेरै धातु आयनहरूको प्रभावको अनुसन्धान गर्न, हामीले सम्बन्धित प्रयोगहरू गर्यौं। चित्र ४ मा देखाइए अनुसार, प्रयोग गरिएको धातुको प्रकारमा निर्भर गर्दै, धातु आयन सांद्रता २.५ mM बाट १० mM सम्म बढाउँदा इन्जाइम कार्यमा नकारात्मक असर पर्यो। उदाहरणका लागि,मिलीग्राम²⁺ , को²⁺ , Zn²⁺, रक्यु²⁺इन्जाइम गतिविधिलाई उत्तेजित र सक्रिय गर्न सक्छ, जबकिना⁺ , मिलियन²⁺ , Ca²⁺, रके⁺इन्जाइम गतिविधिलाई रोक्न सक्छ। १० mM को सांद्रतामा, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 बाट Cu²⁺ र Mg²⁺ आयनहरू laccase गतिविधिको सबैभन्दा शक्तिशाली सक्रियकर्ता थिए, जसले क्रमशः लगभग ३४% र २०% को सक्रियता डिग्री प्रदान गर्यो। यद्यपि, १० mM को सांद्रतामा, Ca²⁺ आयनहरू laccase को सबैभन्दा शक्तिशाली अवरोधक थिए, जसले इन्जाइम गतिविधिलाई लगभग ६०% ले घटायो।
Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase को गतिविधिमा धातु आयनहरूको प्रभाव। laccase लाई सोडियम फस्फेट बफर (0.05 M, pH 7.0) मा 2.5 mM र 10 mM को सांद्रतामा विभिन्न धातु आयनहरू भएको १० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। त्यसपछि प्रतिक्रिया सब्सट्रेट (ABTS) थपेर सुरु गरिएको थियो, जस पछि सापेक्षिक गतिविधि मापन गरिएको थियो।
हाम्रो नतिजा अन्य लेखकहरूको नतिजासँग मिल्दोजुल्दो छ जसले Mg²⁺ र Cu²⁺ ले *Trametes polyzona* WRF03³ को गतिविधि बढाउँछन् भनेर पत्ता लगाए। Castaño et al.⁴⁸ ले पत्ता लगाए कि *Xylaria* sp बाट आएको laccase केही हदसम्म तामा आयनहरू (Cu²⁺) द्वारा उत्तेजित हुन्छ। यसबाहेक, Foroutanfar et al.⁴⁹ र Si et al.⁵⁰ ले क्रमशः *Paraconiothyrium variabile* र *Trametes pubescens* बाट आएको laccases मा समान अध्ययनहरू गरे। यस इन्जाइमको प्रकार II तामा-बाइन्डिङ साइट (T2) दिइएको सांद्रतामा Cu²⁺ सँग संतृप्त हुन सक्छ, जसले उच्च Cu²⁺³⁹ सांद्रतामा laccase गतिविधिको उत्तेजनालाई व्याख्या गर्न सक्छ। सेतो सड्ने फङ्गी ल्याकेसहरू धेरै तामा परमाणुहरू भएको अक्सिडेजहरू भएकाले, ल्याकेस गतिविधिमा तामा आयनहरूको प्रभाव विविध हुन्छ र उत्तेजक र अवरोधकदेखि तटस्थसम्म हुन्छ।⁵¹ यसको विपरीत, झोउ एट अल[52]रिपोर्ट गरियो किक्यु²⁺ताइवान भूमिगत धमिराको लायकेस गतिविधिलाई रोक्यो (ओडोन्टोटर्मेस फॉर्मोसनस)। यद्यपि, सेरेना sp. HYB07 का लायकेसहरू[53]र क्लिटोसाइब म्याक्सिमा[54]तामा आयनहरूले प्रभावित भएनन्।
सब्सट्रेट विशिष्टता यसको गतिज प्यारामिटरहरू (Km र Vmax) द्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको थियो; इन्जाइममा सब्सट्रेटको बाध्यकारी आत्मीयता जति बलियो हुन्छ, Km मान त्यति नै कम हुन्छ र सब्सट्रेट विशिष्टता त्यति नै उच्च हुन्छ।३,२१,५५*Pleurotus ostreatus* NRC 620 बाट laccase को गतिज प्यारामिटरहरू (Km र Vmax) लाई Lineweaver-Burk प्लट (चित्र 5) प्लट गरेर GraphPad Prism 6.0 सफ्टवेयर प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो। ABTS लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गर्दा, परिणामहरू 1.99 mM र 16217 μmol थिए।न्यूनतम⁻¹ ल⁻¹,क्रमशः। एल्सायद एट अल।21ABTS अक्सिडेशनको लागि Km मानहरू क्रमशः ०.१ mM र ०.०६४ mM रहेको रिपोर्ट गरिएको छ, जसले ABTS को लागि Lac A र Lac B आइसोएन्जाइमहरूको उच्च आत्मीयतालाई जनाउँछ। यसबाहेक, Vmax मानहरू ०.१८२ μmol थिए।न्यूनतम⁻¹र ०.६०३ माइक्रोमोलन्यूनतम⁻¹क्रमशः। प्राप्त किमी मान ट्रामेटेस पोलिजोना WRF03 (8.66 mM) भन्दा कम थियो; यसबाहेक, तिनीहरूको Vmax मान (1429 mmol min⁻¹) पनि थियो।तल्लोABTS लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गर्दा।33 त्यसैगरी, Lentinus squarrosulus MR13 र Trametes sp. AH28-2 laccase सांद्रताको Km मान क्रमशः 0.0714 mM र 0.025 mM थियो, र Vmax मानहरू 0.0091 mM min−1 र 0.67 mM min−1 mg−1 (ABTS को सापेक्ष) थिए।क्रमशः।५६,५७
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 बाट laccase को गतिविधिमा ABTS सांद्रताको प्रभावको अनुसन्धान गरियो, र ABTS सांद्रताको तुलनामा प्रारम्भिक प्रतिक्रिया वेगको पारस्परिकताको Lineweaver-Burk प्लट प्लट गरियो। गतिज प्यारामिटरहरू (Vmax र Km) निर्धारण गर्न laccase को विभिन्न सांद्रता (0.025–3.0 mM) भएको ABTS को अक्सिडेशन प्रतिक्रिया pH 4.5 मा मापन गरिएको थियो। Michaelis-Menten गतिज स्थिरांकहरू सब्सट्रेट सांद्रताको तुलनामा प्रतिक्रिया वेगको पारस्परिकको Lineweaver-Burk प्लट प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। GraphPad Prism 6.01 सफ्टवेयर प्रयोग गरेर Lineweaver-Burk प्लटबाट गतिज स्थिरांकहरू गणना गरिएको थियो।
परम्परागत स्पष्टीकरण इन्जाइमहरू, जस्तै पेक्टिनेज, पेक्टिक पदार्थहरूलाई हाइड्रोलाइज गर्छन्, चिपचिपापन र टर्बिडिटी कम गर्छन्। तिनीहरूले संरचनात्मक पोलिसेकराइडहरूलाई प्रभावकारी रूपमा तोड्छन् र प्रायः उत्पादन र स्पष्टता सुधार गर्न सेल्युलेसेस र हेमिसेल्युलेसेस जस्ता अन्य इन्जाइमहरूसँग संयोजनमा प्रयोग गरिन्छ। यद्यपि, पेक्टिनेजहरूले विशेष रूपमा फेनोलिक यौगिकहरूलाई लक्षित गर्दैनन्, जुन टर्बिडिटी र अक्सिडेटिभ ब्राउनिंगमा मुख्य योगदानकर्ता हुन्, विशेष गरी स्याउ र अंगूरको रस जस्ता रसहरूमा।58यसको विपरित, ल्याकेसहरूले फेनोलिक यौगिकहरूको अक्सिडेशनलाई उत्प्रेरित गर्छन्, तिनीहरूलाई ठूला, अघुलनशील अणुहरूमा पोलिमराइज गर्छन् जुन अवसादन वा निस्पंदन द्वारा हटाउन सकिन्छ। यो संयन्त्रले स्पष्टता मात्र सुधार गर्दैन तर फेनोलिक यौगिकहरूको कारणले हुने अक्सिडेटिभ ब्राउनिंगको सम्भावनालाई कम गरेर रसको शेल्फ लाइफ पनि विस्तार गर्दछ। यसबाहेक, ल्याकेस-आधारित स्पष्टीकरण प्रक्रियाहरू हल्का प्रशोधन अवस्थाहरू (pH 3.5-5.5, तापमान 25-40 °C) अन्तर्गत गर्न सकिन्छ, जसले गर्दा तिनीहरूको पोषण वा अर्गानोलेप्टिक गुणहरूसँग सम्झौता नगरी नाजुक रसहरूको लागि उपयुक्त हुन्छ।59अध्ययनहरूले देखाएको छ कि पेक्टिनेज उपचारले १-२ घण्टामा रस स्पष्ट पार्न सक्छ, जबकि ल्याकेस उपचारलाई फेनोलिक यौगिकहरूलाई पूर्ण रूपमा कम गर्न सामान्यतया लामो प्रतिक्रिया समय (३-६ घण्टा) चाहिन्छ। यद्यपि, यो प्रक्रियालाई इन्जाइमलाई स्थिर बनाएर वा मेकानिकल स्पष्टीकरण विधिहरूसँग ल्याकेस संयोजन गरेर अनुकूलित गर्न सकिन्छ।60यस अध्ययनमा, कच्चा अर्कको इन्जाइम प्रोफाइलिङले महत्त्वपूर्ण ल्याकेस र α-एमाइलेज गतिविधिहरू प्रकट गर्यो, जबकि पेक्टिनेज र जाइलानेज गतिविधिहरू अत्यन्तै कम थिए, र सेल्युलेज गतिविधि पत्ता लागेन। त्यसकारण, टर्बिडिटी र फेनोलिक सामग्रीमा कमी मुख्यतया ल्याकेसको कार्यको कारणले भएको थियो, जबकि चिपचिपापनमा परिवर्तन आंशिक रूपमा एमाइलेजको कार्यको कारणले हुन सक्छ।
तालिका १ ले ताजा निचोरिएको स्याउको रस र लाकेस-प्रक्रिया गरिएको नमूनाहरूको भौतिक-रासायनिक प्यारामिटरहरू देखाउँछ। नतिजाहरूले देखाए कि ताजा निचोरिएको स्याउको रसको उत्पादन (७१.५९%) लाकेस-प्रक्रिया गरिएको नमूनाहरू (८७.३४%) भन्दा कम थियो। यी नतिजाहरू पिल्निक र सुन्तलाको निष्कर्षसँग मेल खान्छ।61, जसले फलफूल प्रशोधनमा इन्जाइमहरूको प्रयोगले रसको उत्पादन बढाउन, निस्पंदन सुधार गर्न र एकाग्रताको लागि उच्च-गुणस्तरको, स्पष्ट रस प्राप्त गर्न सक्छ भनेर संकेत गरे। रसको उत्पादनमा वृद्धि मुख्यतया रसमा घुलनशील चिनीको मात्रामा वृद्धिको कारणले हुन्छ। फलफूलको इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिसको समयमा, उत्पादनको कोष भित्तामा रहेका मेसोग्लिया र पेक्टिन नष्ट हुन्छन् र तटस्थ चिनी र एसिड जस्ता घुलनशील पदार्थहरूमा परिणत हुन्छन्।६२।इन्जाइम-उपचार गरिएको स्याउको रसको pH मान नियन्त्रण समूहको भन्दा उल्लेखनीय रूपमा कम थियो (P < ०.०५), र भण्डारणको समयमा दुवै समूहको pH मान उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो (तालिका १)। यी नतिजाहरू मार्क एट अलको नतिजासँग मिल्दोजुल्दो छन्।63, जसले उल्लेख गरे कि गर्मी उपचार पछि भण्डारण पछि काजू फलफूलको रसको pH घट्यो। इन्जाइम उपचार पछि पेक्टिनको क्षय र ग्यालेक्टुरोनिक एसिड गठन भण्डारणको समयमा pH मा वृद्धिको लागि जिम्मेवार हुन सक्छ। इन्जाइम-उपचार गरिएका नमूनाहरूको pH भण्डारण भरि ४.०५ र ४.३१ को बीचमा रह्यो, जबकि उपचार नगरिएको स्याउको रसको pH ४.१२ र ४.३३ को बीचमा रह्यो।
उपचार नगरिएका र ल्याकेस-प्रक्रिया गरिएका नमूनाहरूको कुल अम्लता (TA) ले भण्डारण समय बढ्दै जाँदा घट्दो प्रवृत्ति देखायो (तालिका १)। अम्लतामा कमीको कारण जैविक एसिडहरू कार्बोहाइड्रेट वा इन्जाइमेटिक प्रतिक्रियाहरूमा रूपान्तरण हुनु, साथै रस भण्डारणको समयमा अक्सिडेशन हुनु थियो।64नियन्त्रण स्याउको रस र इन्जाइम-उपचार गरिएको नमूनाहरूको कुल अम्लता अन्य रसहरू (स्ट्रबेरीको रस ०.९%, आलुबखडाको रस २.२%, कुमक्वाटको रस १.०%, खुबानीको रस २.४%, सुन्तलाको रस ०.८%) भन्दा कम थियो, तर अन्य रसहरू (जस्तै, नास्पातीको रस ०.३%) जस्तै थियो।62उपचार नगरिएको ताजा निचोरेको स्याउको रसमा यी भिन्नताहरू बढ्दो अवस्था, आनुवंशिक कारकहरू, परिपक्वता स्तर, र प्रशोधन विधिहरू जस्ता विभिन्न कारकहरूको कारणले हुन सक्छन्।65नियन्त्रण र ल्याकेस-उपचार गरिएको स्याउको रसको कुल अम्लतामा कमी सिंह एट अल द्वारा प्रस्तुत नतिजाहरूसँग मेल खान्छ।66७४ दिनको भण्डारण पछि जिन नुओ स्याउको रसको कुल अम्लतामा कमीको बारेमा। अर्कोतर्फ, ओश्मियान्स्की र वोज्डिलो67परम्परागत स्पष्टीकरण विधिहरूको प्रभावको अध्ययन गर्दा स्याउको रसको अम्लतामा कुनै उल्लेखनीय परिवर्तन फेला परेन।
तालिका १ मा प्रस्तुत गरिएका नतिजाहरूले ल्याकेस-प्रक्रिया गरिएको स्याउको रसको कुल घुलनशील ठोस पदार्थ (TSS) मान उपचार नगरिएको नमूनाको भन्दा बढी रहेको संकेत गर्दछ। यी नतिजाहरू प्रकाशित अध्ययनहरूसँग मेल खान्छ।६८यसबाहेक, तालिका १ ले देखाउँछ कि नियन्त्रण स्याउको रस समूहको TSS मान प्रारम्भिक समय बिन्दुमा ९.५८ थियो र भण्डारण अवधिको अन्त्यमा ११.०५ पुगेको छ। यी मानहरू हमिद एट अल द्वारा रिपोर्ट गरिएको ताजा स्याउको रसको TSS मानहरू भन्दा कम छन्।६९(क्रमशः ११.२ र ११.८०)। ल्याकेस-उपचार गरिएको स्याउको रसको नमूनाहरूको TSS मान उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो, ११.२३ बाट सुरु भएर ४°C मा दुई हप्ता भण्डारण पछि १२.९३ मा पुग्यो (तालिका १)। भण्डारणको समयमा TSS मा यस्तै वृद्धि सिट्रस फलफूल, कागती र मीठो सुन्तलामा पनि देखिएको थियो। भण्डारणको समयमा कुल घुलनशील ठोस पदार्थ (TSS) मा वृद्धि पोलिसेकराइड (स्टार्च) को मोनोसेकराइड (चिनी) मा हाइड्रोलिसिस, रस निर्जलीकरणको कारणले सांद्रतामा वृद्धि, र रसमा पेक्टिनको घुलनशील ठोस पदार्थमा गिरावटको कारण हुन सक्छ। कुल घुलनशील ठोस पदार्थ (TSS) मा वृद्धि सम्भवतः घुलनशील चिनीमा वृद्धिको कारणले हुन सक्छ, जुन पेक्टिन वा सेल्युलोजलाई क्रमशः पेक्टिन वा सेल्युलोजद्वारा घुलनशील चिनीमा रूपान्तरण गरेर, वा स्टार्चको हाइड्रोलिसिसद्वारा चिनीमा बन्न सक्छ, जस्तै हेमेड एट अल द्वारा रिपोर्ट गरिएको छ।६९.स्याउको रसको गुणहरूमा ल्याकेसको प्रभाव दृश्यात्मक रूपमा अवलोकन गर्न सकिन्छ, किनकि ल्याकेस-उपचार गरिएको स्याउको रसले उपचार नगरिएको रस भन्दा राम्रो प्रवाहशीलता र कम चिपचिपापन प्रदर्शन गर्दछ। यो अवलोकन तालिका १ मा रेकर्ड गरिएको छ; इन्जाइम-उपचार गरिएको नमूनाको चिपचिपापन १.८७ cP थियो, जबकि नियन्त्रण नमूनाको चिपचिपापन २.९५ cP थियो। चिपचिपापनमा यो उल्लेखनीय कमी सम्भवतः पेक्टिन-जस्तो पदार्थहरूको उच्च पानी-धारण क्षमता र एकजुट नेटवर्क संरचनाको गठनको कारणले हो।
यस अध्ययनमा, स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर ४२० एनएममा अवशोषण मापन गरेर स्याउको रसको ब्राउनिङ इन्डेक्स (BI) मा ल्याकेसको प्रभावको अनुसन्धान गरिएको थियो। नतिजाहरू तालिका १ मा देखाइएको छ। भण्डारणको क्रममा, उपचार गरिएको र उपचार नगरिएको दुवै समूहहरूमा स्याउको रसको नमूनाहरूको BI ले क्रमिक रूपमा बढ्दो प्रवृत्ति देखायो। BI ले ब्राउनिङको डिग्री प्रतिबिम्बित गर्दछ र यसको रूपमा काम गर्न सक्छएउटा महत्त्वपूर्णइन्जाइम्याटिक र गैर-इनजाइम्याटिक ब्राउनिङ प्रतिक्रियाहरूको सूचक। भण्डारणको समयमा अवशोषण उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो (P < ०.०५)। भण्डारणको अन्त्यमा,A420 लेनियन्त्रण र इन्जाइम-उपचार गरिएका समूहहरूमा स्याउको रसको नमूनाहरूको मूल्य क्रमशः लगभग २१७% र १२१% ले बढेको छ (तालिका १)। नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि इन्जाइम उपचारले प्रभावकारी रूपमा ब्राउनिंग डिग्रीलाई लगभग ५६% ले कम गर्न सक्छ। बेजेरा एट अलको नतिजा।[१९]] हाम्रो नतिजासँग मिल्दोजुल्दो छ; तिनीहरूले स्याउको रसलाई स्पष्ट पार्न ल्याकेस-ग्लुटाराल्डिहाइड-नरिवल फाइबर प्रयोग गरे, जसले गर्दा यसको मूल रंग ६१% ले घट्यो।
फलफूलको जुसमा पाइने पोलिफेनोलहरूले मानव शरीरमा सकारात्मक पोषण र उपचारात्मक प्रभाव पारे तापनि, तिनीहरूले प्रोटिनसँग पनि प्रतिक्रिया गर्न सक्छन्, जसले गर्दा रसमा बादल, अवसादन वा टर्बिडिटी निम्त्याउँछ, जसले गर्दा उत्पादनको स्वाद र सुगन्ध परिवर्तन हुन्छ र यसको शेल्फ लाइफ घट्छ।71यस अध्ययनको उद्देश्य Pleurotus ostreatus NRC 620 बाट laccase प्रयोग गरेर स्याउको रसमा रहेको phenolic यौगिक सामग्रीलाई सुरक्षित रूपमा घटाउनु थियो। तालिका १ मा प्रस्तुत गरिएका नतिजाहरूले ४ डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गर्नुअघि laccase-उपचार गरिएको स्याउको रसको कुल phenolic यौगिक सामग्री उल्लेखनीय रूपमा घटेको देखाउँछन्। यसबाहेक, अध्ययन गरिएका दुवै नमूनाहरूमा भण्डारणको समयमा कुल phenolic यौगिक सामग्री पनि घट्यो (तालिका १)। Sandri et al द्वारा अनुसन्धान।72इन्जाइम-उपचार गरिएको स्याउको रसले यसको एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधि र फेनोलिक यौगिक सामग्री कायम राख्न सक्छ भन्ने देखाएको छ। यद्यपि, लेटेरा एट अल द्वारा गरिएको एक अध्ययनको नतिजा।73सुन्तलाको रसलाई फंगल ल्याकेसले उपचार गर्नाले यसमा रहेको फेनोलिक यौगिकहरूको मात्रा ४५% सम्म घटाउन सकिन्छ भन्ने देखाउँछ।
फेनोलिक यौगिकहरूमा फ्री रेडिकल स्क्याभेन्जिङ, सिंगलेट अक्सिजन रिडक्सन र क्वेन्चिङ, हाइड्रोजन एटम ट्रान्सफर, र फ्री रेडिकलहरूलाई इलेक्ट्रोन दान जस्ता गुणहरू भएको देखाइएको छ, जसले तिनीहरूलाई शक्तिशाली एन्टिअक्सिडेन्ट बनाउँछ।74त्यसकारण, यस अध्ययनमा, १४ दिनको लागि रेफ्रिजरेटरमा भण्डारण गरिएको स्याउको रसको एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधिमा ल्याकेसको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न DPPH र FRAP-आधारित विधिहरू प्रयोग गरिएको थियो (तालिका २)। दुवै विधिहरूले भण्डारणको समयमा एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधिमा वृद्धि देखाएको छ, जुन नि:शुल्क फेनोलिक यौगिकहरूमा वृद्धि वा मेलर्ड प्रतिक्रिया उत्पादनहरू (MRPs) को गठनको कारण हुन सक्छ, मेलर्ड प्रतिक्रिया उत्पादनहरू एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधिमा वृद्धिको कारण हुन सक्छ।75गैर-एन्जाइमेटिक ब्राउनिंग प्रतिक्रियाहरू (एस्कर्बिक एसिड डिग्रेडेसन, मेलर्ड प्रतिक्रियाहरू, र चिनीको एसिड-उत्प्रेरित डिग्रेडेसन सहित) ले खैरो रंगद्रव्यहरू (मेलानोइडिन) उत्पादन गर्दछ। मध्यवर्ती एस्कर्बिक एसिड डिग्रेडेसन उत्पादनहरू र चिनी डिग्रेडेसन उत्पादनहरू (जस्तै कार्बोनिल यौगिकहरू) मेलर्ड प्रतिक्रियाहरू मार्फत एमिनो एसिडहरूसँग प्रतिक्रिया गर्न सक्छन्।76भण्डारणको समयमा फलफूल र तरकारीहरूको खैरोपनको बारेमा व्यापक रूपमा अध्ययन गरिएको भए तापनि, यी प्रतिक्रियाहरूको बारेमा हाम्रो बुझाइ सीमित छ।77FRAP विधिको तुलनामा, ल्याकेस-उपचार गरिएको स्याउको रसले DPPH विधि (तालिका २) द्वारा उल्लेखनीय रूपमा कम एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधि देखायो, र सबै नमूनाहरूको एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधि बढ्दो भण्डारण समयसँगै उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो। यस अध्ययनमा एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधि निर्धारण गर्न दुई फरक विधिहरू प्रयोग गरिएको थियो किनभने तिनीहरूका सिद्धान्तहरू फरक छन्। DPPH विधिले फ्री रेडिकलहरूलाई बेअसर गर्ने क्षमता मापन गर्दछ, जबकि FRAP विधिले फलामको आयनहरू घटाउने क्षमता मापन गर्दछ। त्यसकारण, अध्ययन गरिएका नमूनाहरूको एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधिलाई राम्रोसँग बुझ्न एन्टिअक्सिडेन्ट गतिविधि निर्धारण गर्न धेरै विधिहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।78
यस अध्ययनको एउटा प्रमुख निष्कर्ष यो हो कि *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 ले ७०°C र pH ३.० मा इष्टतम गतिविधि प्रदर्शन गर्दछ। रस स्पष्टीकरणको लागि सामान्यतया प्रयोग हुने अन्य फंगल ल्याकेसहरू, जस्तै *Trametes versicolor* र *Ganoderma lucidum* laccases को तुलनामा, *P. ostreatus* NRC 620 ले उच्च थर्मल स्थिरता र अधिक अम्लीय pH प्रदर्शन गर्दछ। *Trametes versicolor* र *Ganoderma lucidum* बाट ल्याकेसहरूले सामान्यतया ५०-६०°C को दायरामा र ३.५ र ५.० बीचको pH मानहरूमा इष्टतम गतिविधि प्रदर्शन गर्दछ। यो भिन्नताले सुधारिएको रस स्पष्टीकरण दक्षतामा योगदान पुर्याउन सक्छ, विशेष गरी अम्लीय रसहरूको लागि जहाँ कम pH मानहरूमा स्थिरता महत्त्वपूर्ण हुन्छ। *P. को अद्वितीय विशेषता। अन्य अध्ययन गरिएका फंगल ल्याकेसहरूको तुलनामा, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ले थप चुनौतीपूर्ण परिस्थितिहरूमा प्रभावकारी रूपमा काम गर्ने क्षमता प्रदर्शन गर्दछ। यसको उच्च इष्टतम गतिविधि तापक्रमले औद्योगिक अनुप्रयोगहरूमा सम्भावित फाइदाहरू सुझाव दिन्छ, जस्तै छिटो प्रतिक्रिया दर र कम माइक्रोबियल प्रदूषण। यसको कम pH, जुन धेरै रसहरूको अम्लीय प्रकृतिको लागि राम्रोसँग उपयुक्त छ, रस स्पष्टीकरण प्रक्रियाहरूमा उपयोगी हुन सक्छ। यी नतिजाहरूले ठूलो मात्रामा प्रयोगको लागि थप अन्वेषणलाई औचित्य दिन्छ, जसले *Pleurotus ostreatus* NRC 620 लाई परम्परागत फंगल ल्याकेस स्रोतहरूको लागि एक व्यवहार्य विकल्प बनाउँछ। अघिल्ला अध्ययनहरूको तुलनामा, हामीले पत्ता लगायौं कि इष्टतम तापक्रम 60°C छ र इष्टतम pH 3.0 छ। 60°C मा 80 मिनेटको लागि प्रतिक्रिया पछि, *Ganoderma lucidum* ल्याकेस कायम राखियो।46यसको गतिविधिको %।७९ कुर्नियावती र निसेलका अनुसार80, *गानोडर्मा लुसिडम* इन्जाइमहरूले २५°C र pH मानहरू ५.० देखि ८.० सम्ममा उत्कृष्ट देखि मध्यम स्थिरता प्रदर्शन गर्छन्, र pH ६.० र १० देखि ३०°C सम्मको तापक्रममा स्थिरता प्रदर्शन गर्छन्। यस अध्ययनमा, हामीले पत्ता लगायौं कि *प्लेरोटस ओस्ट्रेटस* को लागि इन्जाइम गतिविधिको लागि इष्टतम pH र तापक्रम क्रमशः ३.० र ७०°C थियो। ४०°C र ५०°C मा दुई घण्टाको लागि इन्क्युबेशन पछि, इन्जाइमले यसको गतिविधिको क्रमशः ६८.३३% र ५९.६१% कायम राख्यो। यसबाहेक, प्लेरोटस ओस्ट्रेटस NRC ६२० लेक्केसले ५०°C देखि ८०°C सम्मको विस्तृत तापक्रम दायरामा उच्च गतिविधि प्रदर्शन गर्यो, लगभग अधिकतम गतिविधि (६९%–९८%) मा पुग्यो, अधिकतम गतिविधि ७०°C मा अवलोकन गरियो।
निष्कर्षमा, स्थिर अवस्थामा प्राप्त गरिएको ओइस्टर च्याउ ल्याकेस NRC620 ले pH र तापक्रम अवस्थाहरूको दायरामा इष्टतम गतिविधि र स्थिरता प्रदर्शन गर्यो, अन्य इन्जाइम स्रोतहरूको तुलनामा उच्च स्थिरता प्रदर्शन गर्यो। १० mM MgSO₄ र CuSO₄ थप्दा इन्जाइम गतिविधि क्रमशः लगभग २१% र ३५% ले बढ्यो। स्याउको रसमा प्रशोधन गर्दा, इन्जाइमले pH र चिपचिपापन घटायो, जबकि भण्डारणको समयमा फेनोलिक सामग्री थोरै मात्र घट्यो।
नतिजाहरूले खाद्य उद्योगमा, विशेष गरी पेय पदार्थ स्पष्टीकरणमा, ल्याकेसको सम्भावना पुष्टि गर्दछ। विशेष गरी फेनोलिक यौगिकहरूलाई तोडेर, ल्याकेसले टर्बिडिटी कम गर्ने र स्पष्टता सुधार गर्ने मात्र होइन तर हल्का सञ्चालन अवस्थाहरूमा फलफूलको रसको गुणस्तर पनि कायम राख्छ। जिलेटिन, बेन्टोनाइट र सिलिका जेल जस्ता परम्परागत स्पष्टीकरण एजेन्टहरू भन्दा फरक, ल्याकेसले फोहोर उत्पन्न गर्दैन वा पेय पदार्थहरूबाट सुखद सुगन्ध हटाउँदैन, जसले गर्दा यसलाई वातावरणमैत्री र दिगो विकल्प बनाइन्छ। यसबाहेक, अन्य इन्जाइमहरू र निस्पंदन विधिहरूको तुलनामा, ल्याकेसले उत्पादनको गुणस्तरमा सम्झौता नगरी लक्षित र लागत-प्रभावी समाधान प्रदान गर्दछ।
क्योमुहिम्बो, एचडी र ब्रिंक, एचजी। तामा युक्त ल्याकेसहरूको प्रयोग र स्थिरीकरण रणनीतिहरू; एक समीक्षा। हेलियोन ९, e१३१५६ (२०२३)।
पोस्ट समय: डिसेम्बर-१५-२०२५